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正相色譜和反相色譜的區(qū)別、適用范圍

更新時(shí)間:2023-05-18 點(diǎn)擊次數(shù):6609

高效液相色譜法(HPLC)因其選擇性高、靈敏度高、分析速度快,已成為現(xiàn)代分離測試的重要手段。色譜柱作為高效液相分離系統(tǒng)中的重要環(huán)節(jié),色譜柱的類型決定色譜系統(tǒng)的性質(zhì),色譜柱的粒徑和長度影響分析時(shí)間和分析效率。

在液相色譜分析中,使用較多的分離模式是正相色譜分離模式和反相色譜分離模式,正相色譜和反相色譜怎么區(qū)分,適用范圍是哪些,今天小編就和大家聊一聊。


01 正相色譜


正相色譜(NPC)是采用極性固定相(如帶有二醇基、氨基、和氰基的固定相及硅膠等),流動相通常使用比鍵合相極性小的非極性或弱極性有機(jī)溶劑,如烴類溶劑,或其中加入一定量的極性溶劑(如氯仿、醇、四氫呋喃、乙腈等),以調(diào)節(jié)流動相的洗脫強(qiáng)度。是一種根據(jù)目標(biāo)物的極性差異將其分開的液相色譜技術(shù)。

劃重點(diǎn):正相色譜=固定相極性>流動相極性




一般認(rèn)為正相色譜的分離機(jī)制屬于分配色譜。

● 在正相色譜中,樣品分子與載體基質(zhì)的硅醇基團(tuán)發(fā)生特異的極性相互作用,與固定相產(chǎn)生強(qiáng)極性相互作用的極性樣品分子比較難被洗脫,在柱內(nèi)停留比較長的時(shí)間。

反之,極性較弱或非極性分子與硅膠之間產(chǎn)生相對較弱的相互作用,比較容易被洗脫,因而在柱內(nèi)停留的時(shí)間較短。組分的分配比K值,隨其極性的增加而增大,但隨流動相中極性溶劑的極性增大(或濃度增大)而降低。

● 同時(shí),固定相的極性越大,組分的保留值越大。

因此,正相色譜可以根據(jù)目標(biāo)物的極性差別而達(dá)到分離目的。

在正相色譜分離中,可通過薄層色譜法(TLC)選擇合適的流動相。

正相色譜常用的四種固定相,極性大小順序是:

硅膠>氨基>二醇基>氰基

正相色譜的適用范圍:

1)適合用于分離異構(gòu)體;

2)適用于絕不溶于水的化合物;

3)適用于分離在反相色譜中不保留或極性較強(qiáng)的化合物,比如生物堿、核苷酸類、有機(jī)酸等。


02 反相色譜


反相色譜(RPC)是指利用非極性的反相介質(zhì)為固定相,極性有機(jī)溶劑、水溶液為流動相,根據(jù)溶質(zhì)極性(疏水性)的差別進(jìn)行溶質(zhì)分離與純化的洗脫色譜法。

● 反相色譜的固定相大多是在硅膠表面鍵合疏水基團(tuán),基于樣品中的不同組分和疏水基團(tuán)之間疏水作用的不同而分離。

● 在生物大分子分離中,多采用離子強(qiáng)度較低的酸性水溶液,添加一定量乙腈、異丙醇或甲醇等與水互溶的有機(jī)溶劑作為流動相。

● 樣品流出色譜柱的順序是極性較強(qiáng)的組分最先被沖洗出,而極性弱的組分會在色譜柱保留更強(qiáng),后出峰。

劃重點(diǎn):反相色譜=固定相極性<流動相極性




反相色譜常用的固定相種類有:

C18、C8、C4、C3、C1、苯基、C30、PFP等。

反相色譜主要應(yīng)用于相對分子質(zhì)量低于5000,特別是1000以下的弱極性和非極性小分子物質(zhì)的分析和純化,如蛋白質(zhì)、肽、氨基酸、核酸、甾類、脂類、脂肪酸、糖類、植物堿等含有非極性基團(tuán)的各種物質(zhì)。

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